Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab 7L1: sc-403366-ACT

RAB29 code la petite GTPase Rab 7L1, un régulateur du trafic membranaire associé à l’appareil de Golgi, qui coordonne le bourgeonnement des vésicules, le tri des cargaisons et la dynamique du transport endosomal–lysosomal. Rab 7L1 participe à des voies contrôlant le trafic rétrograde et l’homéostasie du Golgi, assurant la localisation correcte et le renouvellement des protéines au sein des systèmes sécrétoire et dégradatif. Dans les cellules humaines, RAB29 a été associé à des programmes de trafic induits par le stress et à des interactions fonctionnelles avec des composants de l’axe autophagie–lysosome, des processus souvent étudiés dans la recherche sur la neurodégénérescence et la signalisation inflammatoire. Des altérations de l’activité de RAB29/Rab 7L1 ont été étudiées dans le contexte de réseaux associés à la maladie de Parkinson, notamment via la modulation de phénotypes de trafic liés à LRRK2, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques du contrôle qualité des organites.

Rab 7L1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAB29 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 7L1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAB29 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAB29, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 7L1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAB29 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 7L1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 7L1 dans les cellules tumorales présentant une expression de RAB29 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.