Rab 5C Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403247-ACT

Il gene umano RAB5C codifica Rab 5C, una piccola GTPasi che regola la fusione degli endosomi precoci, l’endocitosi mediata da recettore e le dinamiche del traffico endosomiale che modellano il riciclo di membrana e la durata della segnalazione. Alternando stati legati a GDP e a GTP, Rab 5C coordina il reclutamento di effettori coinvolti nell’ancoraggio delle vescicole, nello smistamento del carico e nel rimodellamento dei fosfoinositidi, influenzando vie quali il turnover dei recettori per i fattori di crescita e l’assorbimento di nutrienti. L’attività della famiglia Rab5 interagisce con il trasporto mediato dal citoscheletro e con l’instradamento dagli endosomi ai lisosomi, con effetti su processi che includono proliferazione, polarità e risposte a segnali extracellulari. Alterazioni del traffico endocitico e della segnalazione dipendente da Rab5 sono state associate a iperattivazione dei recettori legata al cancro, a meccanismi neurodegenerativi connessi a deficit del trasporto vescicolare e alla biologia delle infezioni, in cui i patogeni sfruttano le vie di ingresso endosomiale dell’ospite.

Rab 5C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB5C senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 5C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB5C nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB5C, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 5C. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB5C nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 5C nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 5C nelle cellule tumorali con espressione di RAB5C silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.