Rab 3B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403407-ACT

RAB3B codifica Rab 3B, una piccola GTPasi arricchita nei neuroni e nei tessuti endocrini, che regola il traffico vescicolare Ca2+-dipendente e l’esocitosi accoppiata allo stimolo. Come interruttore molecolare che cicla tra gli stati legati a GDP e a GTP, Rab 3B coordina l’ancoraggio e il priming delle vescicole attraverso interazioni con effettori di Rab, contribuendo alla dinamica delle vescicole sinaptiche e alle vie di secrezione regolata. Alterazioni dei network di trasporto vescicolare associate a RAB3B sono rilevanti negli studi sulla segnalazione neuroendocrina e sui fenotipi cellulari dipendenti dalla secrezione, e la deregolazione dei circuiti delle Rab GTPasi è stata investigata in contesti neurologici e oncologici. Per questo motivo, questo gene è comunemente utilizzato per esplorare punti di controllo del traffico di membrana che plasmano la secrezione, la neurotrasmissione e la fedeltà del trasporto intracellulare.

Rab 3B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB3B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 3B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB3B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB3B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 3B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB3B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 3B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 3B nelle cellule tumorali con espressione di RAB3B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.