Rab 27b Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403498-ACT

RAB27B codifica la piccola GTPasi Rab27b, un membro della famiglia Rab che regola le fasi del traffico di membrana necessarie per l’ancoraggio, il priming e la fusione delle vescicole secretorie con la membrana plasmatica. Attraverso interazioni con proteine effettrici come le proteine simili alla sinaptotagmina e con partner di legame specifici di Rab27, Rab27b coordina l’esocitosi regolata, la maturazione dei granuli e il rilascio del carico in contesti secretori e correlati al sistema immunitario. Questa via contribuisce a processi quali la secrezione dei granuli densi piastrinici, il traffico delle vescicole endocrine e il controllo del rilascio di vescicole extracellulari/esosomi, collegando RAB27B alla comunicazione intercellulare e alla segnalazione del microambiente. Un traffico dipendente da Rab27b deregolato è stato associato ad alterazioni dei programmi secretori in condizioni infiammatorie e nella biologia dei tumori, rendendolo rilevante per studi meccanicistici sulla secrezione legata alla metastasi, sulle interazioni tumore–stroma e sulla modulazione immunitaria.

Rab 27b Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB27B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 27b Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB27B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB27B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 27b. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB27B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 27b nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 27b nelle cellule tumorali con espressione di RAB27B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.