Rab 1A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401515-ACT

RAB1A codifica a pequena GTPase Rab1A, um regulador central do tráfego do retículo endoplasmático (RE) para o Golgi, que coordena o ancoramento, o acoplamento e a fusão de vesículas COPII para manter o fluxo da via secretória e a homeostase das organelas. Ao controlar a dinâmica do transporte de membranas, a Rab1A influencia a organização do Golgi, o processamento de glicoproteínas, eventos de tráfego relacionados à autofagia e redes mais amplas de proteostase. A perturbação do transporte mediado por RAB1A tem sido associada a respostas de estresse celular e à desregulação de vias de sinalização de crescimento, tornando-o relevante para estudos de defeitos no transporte vesicular, desequilíbrio de proteostase e reprogramação de vias em modelos de doença. Como um nó conservado na logística intracelular, a Rab1A é frequentemente investigada em fluxos de trabalho de genômica funcional que conectam fenótipos de tráfego a saídas de sinalização e metabólicas.

Rab 1A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAB1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rab 1A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAB1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAB1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rab 1A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAB1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rab 1A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rab 1A em células tumorais com expressão de RAB1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.