PSPH Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403897-ACT

A fosfoserina fosfatase (PSPH) é uma enzima citosólica que catalisa a etapa final da via biossintética da serina fosforilada, convertendo L-fosfoserina em L-serina. Ao controlar a disponibilidade de serina de novo, a PSPH influencia o metabolismo de um carbono, a síntese de nucleotídeos, a homeostase redox e o metabolismo subsequente de lipídios e aminoácidos que sustentam programas celulares proliferativos e de adaptação ao estresse. A atividade da PSPH se conecta ao redirecionamento metabólico comumente estudado em células de rápida divisão e em microambientes com limitação de nutrientes, nos quais o fluxo de serina pode moldar a regulação epigenética e as respostas ao estresse oxidativo. A expressão desregulada de PSPH tem sido investigada em contextos de metabolismo e controle de crescimento alterados, tornando-a relevante para estudos mecanísticos de dependência de vias metabólicas.

PSPH O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PSPH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PSPH O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PSPH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PSPH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PSPH. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PSPH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PSPH no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PSPH em células tumorais com expressão de PSPH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.