PRP4 kinase Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-422432-ACT

O gene Prpf4b de camundongo codifica a quinase PRP4, uma quinase de serina/treonina que conecta o controle do splicing de pré‑mRNA à progressão do ciclo celular ao fosforilar componentes do spliceossomo e modular a montagem do spliceossomo catalítico. A atividade da quinase PRP4 influencia programas de processamento de RNA que moldam os perfis de expressão gênica, com efeitos a jusante sobre a estabilidade do genoma e as respostas ao estresse. A sinalização desregulada de quinases do splicing tem sido associada a proliferação alterada e a isoformas de transcritos aberrantes em vias relacionadas ao câncer, tornando Prpf4b um ponto útil para estudar a regulação dependente de splicing. Em modelos murinos, a perturbação de Prpf4b dá suporte a estudos mecanísticos sobre metabolismo de RNA, sinalização de checkpoints e vulnerabilidades dependentes do contexto em células que se dividem rapidamente ou comprometidas com a diferenciação.

PRP4 kinase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Prpf4b sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PRP4 kinase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Prpf4b em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Prpf4b, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PRP4 kinase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Prpf4b nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PRP4 kinase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PRP4 kinase em células tumorais com expressão de Prpf4b silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.