Polycystin-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400983-ACT

PKD1 codifica la glicoproteina di membrana umana policistina-1, una grande proteina di tipo recettoriale localizzata nelle ciglia primarie e nelle giunzioni cellula–cellula, dove contribuisce alla segnalazione meccanosensoriale e all’architettura tissutale. La policistina-1 agisce in concerto con la policistina-2 per modulare la segnalazione calcio-dipendente, influenzando vie che regolano la polarità epiteliale, la proliferazione e le interazioni con la matrice extracellulare. L’alterazione di PKD1 compromette la trasduzione del segnale associata alle ciglia e i programmi di morfogenesi tubulare negli epiteli renali. Le modifiche genetiche di PKD1 sono fortemente associate alla malattia renale policistica autosomica dominante e a fenotipi correlati che comportano formazione di cisti e rimodellamento progressivo degli organi.

Polycystin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PKD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Polycystin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PKD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PKD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Polycystin-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PKD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Polycystin-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Polycystin-1 nelle cellule tumorali con espressione di PKD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.