POLR1E Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407602-ACT

POLR1E codifica uma subunidade central da RNA polimerase I, um complexo multiproteico responsável pela transcrição dos precursores de RNA ribossômico que iniciam a biogênese dos ribossomos no nucléolo. Ao sustentar a síntese e o processamento do pré-rRNA, POLR1E contribui para o controle do crescimento celular, a capacidade de proteostase e as vias de sinalização de estresse nucleolar que conectam a produção de ribossomos à regulação do ciclo celular. A perturbação da função da RNA polimerase I pode desorganizar a homeostase da síntese proteica e ativar respostas ao estresse, como checkpoints associados ao p53, tornando POLR1E relevante para estudos de proliferação, diferenciação e estabilidade do genoma. Evidências genéticas associam a disfunção de POLR1E a fenótipos de ribossomopatias humanas e a distúrbios do desenvolvimento, ressaltando sua importância em tecidos com alta demanda biossintética.

POLR1E O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de POLR1E sem alterar a sequência de ADN subjacente.

POLR1E O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus POLR1E em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição POLR1E, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de POLR1E. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus POLR1E nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de POLR1E no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via POLR1E em células tumorais com expressão de POLR1E silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.