PLC ζ Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403348-ACT

O PLCZ1 humano codifica a fosfolipase C zeta (PLC ζ), uma fosfolipase de fosfoinositídeos específica de espermatozoides que inicia oscilações de Ca2+ após a fusão dos gâmetas ao hidrolisar PIP2 para gerar IP3 e DAG. Esse programa de sinalização por cálcio impulsiona a ativação do oócito e eventos iniciais do desenvolvimento embrionário, posicionando a PLC ζ como um regulador-chave da transdução de sinais associada à fecundação. A expressão ou a função desregulada de PLCZ1 tem sido associada à ativação anormal do óvulo e a certas formas de infertilidade masculina, tornando-o relevante para estudos de biologia reprodutiva e sinalização do desenvolvimento. Como uma isoforma de PLC altamente especializada, a PLC ζ também serve como modelo para dissecar a atividade de PLC independente de estímulo, o feedback dependente de Ca2+ e vias mediadas pelo receptor de IP3.

PLC ζ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PLCZ1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PLC ζ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PLCZ1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PLCZ1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PLC ζ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PLCZ1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PLC ζ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PLC ζ em células tumorais com expressão de PLCZ1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.