plakophilin 1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403577-ACT

PKP1 codifica a plakofilina 1, uma proteína com repetições do tipo armadillo que se localiza nos desmossomos e sustenta a adesão célula–célula dependente de cálcio ao estabilizar complexos de caderinas desmossomais com plakoglobina e ao conectar as placas juncionais aos filamentos intermediários. Essa atividade de “andaime” (scaffolding) ajuda a manter a integridade epitelial, a função de barreira e a resiliência mecânica em tecidos estratificados, havendo ainda relatos de funções adicionais na organização do citoesqueleto e na sinalização juncional. Alterações na expressão de PKP1 ou sua relocalização inadequada nas junções podem prejudicar a montagem dos desmossomos e a diferenciação epitelial, contribuindo para fenótipos de fragilidade cutânea e para uma arquitetura tecidual aberrante. Como fator associado aos desmossomos, PKP1 é amplamente estudado em vias que regulam a adesão celular, a morfogênese tecidual e as respostas do epitélio ao estresse.

plakophilin 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PKP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

plakophilin 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PKP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PKP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de plakophilin 1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PKP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de plakophilin 1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via plakophilin 1 em células tumorais com expressão de PKP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.