PKD2 Particelle di Attivazione Lentivirale (m2): sc-430381-LAC-2

Nel topo, Prkd2 codifica la protein chinasi D2 (PKD2), una chinasi serina/treonina della famiglia PKD che trasduce segnali a valle del diacilglicerolo e delle nuove isoforme di PKC per coordinare programmi di fosforilazione che controllano l’espressione genica, il traffico vescicolare, la dinamica del citoscheletro e la sopravvivenza cellulare. L’attività di PKD2 è spesso collegata a segnali associati all’apparato di Golgi e alle membrane, integrando input provenienti dalle vie dei GPCR e dei recettori tirosina-chinasici per regolare risposte associate a MAPK e NF-κB e il rimodellamento cellulare dipendente dallo stimolo. La deregolazione della segnalazione PRKD2/PKD2 è stata associata a proliferazione anomala, segnalazione infiammatoria e caratteristiche metastatiche nella biologia dei tumori, oltre a ruoli più ampi in processi legati allo stress e al sistema immunitario. L’editing genetico di Prkd2 in modelli murini supporta studi meccanicistici della funzione del dominio chinasi, del cross-talk tra vie di segnalazione e di fenotipi dipendenti dalla fosforilazione mediante approcci di proteomica, imaging in cellule vive e paradigmi in vivo rilevanti per le malattie.

Le particelle di attivazione lentivirale PKD2 (m2) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Prkd2 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale PKD2 (m2) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Prkd2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di PKD2. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Prkd2 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.