PKD2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-430381-ACT

Prkd2 codifica la protein chinasi D2 (PKD2), una chinasi serina/treonina della famiglia PKD di tipo CAMK-like che trasduce segnali a valle del diacilglicerolo e della proteina chinasi C. PKD2 regola il controllo dell’espressione genica dipendente dalla fosforilazione, il traffico vescicolare dalla rete trans-Golgi, il rimodellamento del citoscheletro e programmi di sopravvivenza in risposta allo stress, integrando input provenienti dalla segnalazione mediata da GPCR e da recettori tirosin-chinasici. Nelle cellule murine, l’attività di PKD2 è stata collegata a vie che governano l’attivazione delle cellule immunitarie, la segnalazione infiammatoria e la migrazione cellulare, tramite la modulazione di output trascrizionali associati a MAPK e NF-κB. La deregolazione della segnalazione di PKD2 è studiata in contesti quali proliferazione aberrante, rimodellamento tissutale e meccanismi di malattie infiammatorie, a supporto della sua utilità come nodo per l’interrogazione delle vie di segnalazione.

PKD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Prkd2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PKD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Prkd2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Prkd2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PKD2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Prkd2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PKD2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PKD2 nelle cellule tumorali con espressione di Prkd2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.