PKC gamma Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400503-ACT

PRKCG codifica a proteína quinase C gama (PKCγ), uma quinase serina/treonina convencional dependente de Ca2+/diacilglicerol, enriquecida em tecidos neuronais, que transmite sinais a jusante da fosfolipase C e da renovação de fosfoinositídeos mediada por receptores. A PKCγ fosforila diversos substratos para modular a sinalização sináptica, a dinâmica do citoesqueleto e a expressão gênica dependente de atividade, integrando sinais de segundos mensageiros às redes MAPK/ERK e a outras redes de quinases. No sistema nervoso central, a atividade de PRKCG influencia a neurotransmissão e a plasticidade neuronal, e sua regulação alterada tem sido associada a fenótipos neurodegenerativos e do neurodesenvolvimento, incluindo ataxias hereditárias. Essas propriedades tornam o PRKCG um nó útil para dissecar mecanismos de transdução de sinais e o “cross-talk” entre vias em modelos celulares e neuronais humanos.

PKC gamma O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PRKCG sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PKC gamma O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PRKCG em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PRKCG, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PKC gamma. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PRKCG nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PKC gamma no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PKC gamma em células tumorais com expressão de PRKCG silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.