PHOSPHO1 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-433594-LAC

Phospho1 codifica PHOSPHO1, una fosfatasi citosolica arricchita nei tessuti in via di mineralizzazione che idrolizza la fosfoetanolammina e la fosfocolina per generare fosfato inorganico necessario alla formazione di idrossiapatite mediata dalle vescicole della matrice. PHOSPHO1 agisce insieme alle pirofosfatasi nucleotidiche extracellulari e alle fosfatasi alcaline per regolare l’equilibrio locale fosfato/pirofosfato che controlla la deposizione dei minerali biominerali. Nei modelli murini, un’alterata attività di PHOSPHO1 compromette la mineralizzazione scheletrica guidata dagli osteoblasti, collegando questa via a difetti di formazione ossea e a fenotipi di densità minerale. Questa biologia rende PHOSPHO1 un nodo rilevante per studiare i programmi di osteogenesi, la biologia delle vescicole della matrice e l’omeostasi del fosfato nella ricerca muscoloscheletrica.

Le particelle di attivazione lentivirale PHOSPHO1 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Phospho1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale PHOSPHO1 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Phospho1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di PHOSPHO1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Phospho1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.