PEPCK-C/PCK1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422131-ACT

Il gene murino Pck1 codifica la fosfoenolpiruvato carbossichinasi citosolica (PEPCK-C), un enzima limitante della gluconeogenesi che converte l’ossalacetato in fosfoenolpiruvato e collega gli intermedi del ciclo di Krebs (TCA) alla produzione di glucosio. La PEPCK-C integra i segnali ormonali e nutrizionali per coordinare la produzione epatica di glucosio e, più in generale, il flusso di carbonio attraverso glicolisi/gluconeogenesi e le vie anaplerotiche/cataplerotiche. Una regolazione alterata di Pck1 è spesso utilizzata come indicatore molecolare dell’adattamento metabolico, incluse le risposte al digiuno, la segnalazione di insulina e glucagone e i cambiamenti nel ciclo dei substrati tra mitocondrio e citosol. Una espressione deregolata di Pck1 è rilevante per fenotipi metabolici quali resistenza all’insulina, steatosi epatica e compromissione dell’omeostasi del glucosio nei modelli murini.

PEPCK-C/PCK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Pck1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PEPCK-C/PCK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Pck1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Pck1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PEPCK-C/PCK1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Pck1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PEPCK-C/PCK1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PEPCK-C/PCK1 nelle cellule tumorali con espressione di Pck1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.