PDX-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400792-ACT

PDX1 codifica o PDX-1, um fator de transcrição homeobox que coordena o desenvolvimento pancreático e mantém a identidade de células β maduras ao regular a transcrição do gene da insulina e programas de diferenciação endócrina. Em células humanas, o PDX-1 integra sinais responsivos a nutrientes e a fatores de crescimento com redes transcricionais que controlam a detecção de glicose, a capacidade secretória e as respostas ao estresse celular. A atividade desregulada de PDX-1 está associada a comprometimento da função das células β e a alterações na especificação de linhagens pancreáticas, o que o torna relevante para estudos de mecanismos relacionados ao diabetes e da biologia do desenvolvimento pancreático. Como regulador mestre, o PDX-1 é frequentemente utilizado para investigar o circuito transcricional que governa decisões de destino endócrino e a homeostase metabólica.

PDX-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PDX1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PDX-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PDX1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PDX1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PDX-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PDX1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PDX-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PDX-1 em células tumorais com expressão de PDX1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.