PCTAIRE-3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422147-ACT

Cdk18 codifica la chinasi serina/treonina PCTAIRE-3, un membro della famiglia delle chinasi correlate alle chinasi ciclina-dipendenti, implicato nel coordinare la segnalazione associata al ciclo cellulare con i processi del citoscheletro e del traffico di membrana. Nelle cellule di topo, l’attività di PCTAIRE-3 è stata collegata alla regolazione della proliferazione cellulare, dei programmi di differenziamento e di nodi di segnalazione responsivi allo stress che integrano cascate chinasi con output trascrizionali. Come per altre CDK atipiche, un’alterata espressione o un diverso contesto di segnalazione può influenzare vie rilevanti per l’omeostasi tissutale, lo sviluppo neuronale o della linea germinale e fenotipi oncogenici, tramite effetti sul controllo dei checkpoint e sulla sopravvivenza cellulare. Queste proprietà rendono Cdk18 un bersaglio utile per analizzare l’architettura delle reti di chinasi e la regolazione della crescita e del differenziamento dipendente dal contesto.

PCTAIRE-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Cdk18 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PCTAIRE-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Cdk18 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Cdk18, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PCTAIRE-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Cdk18 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PCTAIRE-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PCTAIRE-3 nelle cellule tumorali con espressione di Cdk18 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.