PCTAIRE-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-422147-ACT

Cdk18 codifica a quinase de serina/treonina PCTAIRE-3, membro da família de quinasas relacionadas às quinases dependentes de ciclina, implicada em coordenar a sinalização associada ao ciclo celular com processos do citoesqueleto e de tráfego de membranas. Em células de camundongo, a atividade de PCTAIRE-3 tem sido associada à regulação da proliferação celular, de programas de diferenciação e de nós de sinalização responsivos ao estresse que integram cascatas de quinasas a respostas transcricionais. Como ocorre com outras CDKs atípicas, alterações na expressão ou no contexto de sinalização podem influenciar vias relevantes para a homeostase tecidual, o desenvolvimento neuronal ou da linhagem germinativa e fenótipos oncogênicos, por meio de efeitos sobre o controle de checkpoints e a sobrevivência celular. Essas propriedades tornam o Cdk18 um alvo útil para dissecar a organização das redes de quinasas e a regulação dependente do contexto do crescimento e da diferenciação.

PCTAIRE-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Cdk18 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PCTAIRE-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Cdk18 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Cdk18, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PCTAIRE-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Cdk18 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PCTAIRE-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PCTAIRE-3 em células tumorais com expressão de Cdk18 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.