PCTAIRE-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404867-ACT

CDK18 codifica a quinase de serina/treonina PCTAIRE-3, um membro da família das quinases dependentes de ciclina implicado na regulação de redes de sinalização e fosforilação ligadas ao ciclo celular. A PCTAIRE-3 tem sido associada ao controle da proliferação celular e de vias responsivas ao estresse, e acredita-se que sua atividade se integre a cascatas de quinases que influenciam programas transcricionais e a homeostase celular. A desregulação da expressão ou da sinalização de CDK18 foi relatada em estudos sobre distúrbios proliferativos e biologia tumoral, sustentando sua utilidade como alvo de pesquisa para investigar mecanismos de controle do crescimento e manutenção do genoma. A modulação experimental dos níveis de CDK18 pode, portanto, contribuir para o mapeamento de vias em contextos de regulação do ciclo celular e sinalização oncogênica.

PCTAIRE-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CDK18 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PCTAIRE-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CDK18 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CDK18, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PCTAIRE-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CDK18 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PCTAIRE-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PCTAIRE-3 em células tumorais com expressão de CDK18 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.