PAR-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400333-ACT

F2RL1 codifica il recettore attivato da proteasi-2 (PAR-2), un recettore accoppiato a proteine G che viene attivato dalla scissione operata da proteasi seriniche, la quale espone un ligando “ancorato” e avvia la segnalazione intracellulare. PAR-2 si accoppia a Gαq/11, Gαi/o e Gα12/13 per regolare il flusso di Ca2+ mediato dalla fosfolipasi C, il rimodellamento del citoscheletro tramite RhoA, le cascate MAPK/ERK e la trascrizione guidata da NF-κB, modulando così le risposte infiammatorie e di barriera. Questo recettore è ampiamente espresso nei compartimenti epiteliali ed endoteliali, oltre che nelle cellule immunitarie, collegando l’attività delle proteasi extracellulari al rilascio di citochine, al traffico leucocitario e alla segnalazione nocicettiva. Una segnalazione di PAR-2 deregolata è stata implicata in infiammazione cronica, fibrosi, iperreattività delle vie aeree, prurito e rimodellamento del microambiente associato ai tumori, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici delle vie guidate dalle proteasi.

PAR-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di F2RL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PAR-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus F2RL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione F2RL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PAR-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus F2RL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PAR-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PAR-2 nelle cellule tumorali con espressione di F2RL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.