PAPD1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-412459-ACT

MTPAP codifica a poli(A) polimerase mitocondrial PAPD1, uma enzima de processamento de RNA que adiciona caudas poli(A) aos mRNAs mitocondriais para apoiar a estabilidade e a maturação dos transcritos e promover uma tradução mitocondrial eficiente. Por meio de sua atuação na expressão gênica mitocondrial, a PAPD1 contribui para a capacidade de fosforilação oxidativa, a homeostase da cadeia respiratória e programas mais amplos de controle de qualidade mitocondrial. A poliadenilação desregulada de RNAs mitocondriais pode perturbar o metabolismo energético e amplificar respostas de estresse celular associadas a fenótipos neuromusculares e neurodegenerativos. Como resultado, MTPAP/PAPD1 é frequentemente estudado em vias que conectam a biologia do RNA mitocondrial à bioenergética, à proteostase e à sobrevivência celular sob estresse metabólico.

PAPD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MTPAP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PAPD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MTPAP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MTPAP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PAPD1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MTPAP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PAPD1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PAPD1 em células tumorais com expressão de MTPAP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.