Pannexin-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401635-ACT

PANX1 codifica pannexina-1, un canale di membrana plasmatica a grande poro che media il rilascio di ATP e metaboliti per coordinare la segnalazione purinergica e la comunicazione paracrina. L’attività della pannexina-1 è accoppiata alla depolarizzazione di membrana, allo stress meccanico e a segnali infiammatori, influenzando la dinamica del Ca²⁺, la segnalazione associata all’inflammasoma e il rimodellamento del citoscheletro. Attraverso la regolazione del tono dei nucleotidi extracellulari e dei segnali “find-me” durante l’apoptosi, PANX1 contribuisce al reclutamento delle cellule immunitarie, alla migrazione cellulare e all’omeostasi tissutale. Una segnalazione PANX1 deregolata è stata collegata in letteratura a neuroinfiammazione, vie associate al dolore, risposte lesionali legate all’ischemia e interazioni nel microambiente tumore–sistema immunitario, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico in modelli rilevanti per la malattia.

Pannexin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PANX1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pannexin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PANX1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PANX1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pannexin-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PANX1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pannexin-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pannexin-1 nelle cellule tumorali con espressione di PANX1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.