PAM CRISPR Activationプラスミド (h): sc-404391-ACT

ヒトのPAMは、ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼ（peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase）をコードしており、銅およびアスコルビン酸（ビタミンC）依存性の二機能酵素として、ペプチドホルモンやニューロペプチドのC末端アミド化を触媒します。これは生理活性の発現に必須となる成熟過程の一段階です。PAMは主に分泌経路に局在し、制御性エキソサイトーシスとペプチドのプロセシングを結び付けることで、神経内分泌および神経細胞のシグナル伝達を支えます。アミド化ペプチドのプールを制御することを通じて、PAMは代謝、ストレス応答、シナプス機能を調節する細胞間コミュニケーション経路に影響を与えます。PAMの発現や活性の変化は、神経内分泌の調節異常や神経疾患に関連する表現型と関連づけられており、分泌顆粒の生物学やペプチド媒介性シグナル伝達の研究において重要な標的となっています。

PAM CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性PAMの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

PAM CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における PAM 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はPAM転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性PAMの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のPAM遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるPAM依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびPAM発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるPAM経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。