p57 Kip2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400444-ACT

CDKN1C codifica p57^Kip2, un inibitore delle chinasi ciclina-dipendenti della famiglia CIP/KIP soggetto a imprinting, che frena l’attività di CDK2 e CDK1 per imporre l’arresto in G1 e coordinare i programmi di differenziamento. p57^Kip2 integra segnali provenienti da vie di sviluppo e da pathway attivati da fattori di crescita, inclusi gli input degli assi TGF-β/SMAD e PI3K–AKT, per modulare i checkpoint del ciclo cellulare, l’impegno di linea e il controllo della crescita tissutale. L’espressione deregolata di CDKN1C e i difetti di imprinting sono associati a proliferazione aberrante e disturbi dello sviluppo, e livelli alterati di p57^Kip2 sono spesso studiati in contesti quali la biologia del cancro, la quiescenza delle cellule staminali e lo sviluppo placentare. In quanto regolatore nucleare della proliferazione, p57^Kip2 è rilevante anche per la regolazione epigenetica del cluster di imprinting 11p15 e per le vie che governano la senescenza e le transizioni di destino cellulare.

p57 Kip2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDKN1C senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p57 Kip2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDKN1C nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDKN1C, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p57 Kip2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDKN1C nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p57 Kip2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p57 Kip2 nelle cellule tumorali con espressione di CDKN1C silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.