p53 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423509-ACT

O Trp53 de camundongo codifica o fator de transcrição p53, um regulador central da integridade do genoma que integra danos ao DNA, estresse oncogênico e sinais metabólicos para coordenar a parada do ciclo celular, a senescência, a apoptose e o reparo do DNA. A atividade de p53 interage com a sinalização ATM/ATR–CHK, com o circuito de retroalimentação negativa mediado por MDM2 e com vias que controlam o estresse oxidativo e a homeostase mitocondrial. A disrupção ou atenuação da sinalização de p53 é amplamente relevante para a biologia tumoral e influencia resultados experimentais em estudos de estresse genotóxico, regulação da cromatina e programas gênicos imunomodulatórios. Em sistemas de modelos murinos, o ajuste da expressão de Trp53 é comumente usado para investigar mecanismos de adaptação ao estresse e fenótipos associados à transformação.

p53 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Trp53 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

p53 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Trp53 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Trp53, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de p53. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Trp53 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de p53 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via p53 em células tumorais com expressão de Trp53 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.