P2Y9 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-429620-ACT

Il gene murino Lpar4 codifica il recettore purinergico accoppiato a proteine G P2Y9, un sensore di superficie per nucleotidi extracellulari che si accoppia a proteine G eterotrimeriche per modulare la segnalazione dei secondi messaggeri. L’attività di P2Y9 può influenzare vie guidate dai GPCR, come la mobilizzazione del calcio dipendente dalla fosfolipasi C, la regolazione del cAMP e la segnalazione a valle MAPK/ERK, contribuendo così a modellare la comunicazione cellulare, la migrazione e le risposte infiammatorie. Poiché la segnalazione mediata dai nucleotidi è strettamente legata allo stress tissutale e all’attivazione immunitaria, un’alterazione della segnalazione P2Y9/Lpar4 è rilevante per studi su infiammazione, regolazione vascolare e metabolica, e cambiamenti di segnalazione del microambiente osservati nella biologia delle malattie.

P2Y9 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Lpar4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

P2Y9 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Lpar4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Lpar4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di P2Y9. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Lpar4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da P2Y9 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via P2Y9 nelle cellule tumorali con espressione di Lpar4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.