P2Y9 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-429620-ACT

O Lpar4 de camundongo codifica o receptor purinérgico acoplado à proteína G P2Y9, um sensor de superfície celular para nucleotídeos extracelulares que se acopla a proteínas G heterotriméricas para modular a sinalização de segundos mensageiros. A atividade do P2Y9 pode influenciar vias mediadas por GPCR, como a mobilização de cálcio dependente de fosfolipase C, a regulação de cAMP e a sinalização MAPK/ERK a jusante, moldando assim a comunicação celular, a migração e as respostas inflamatórias. Como a sinalização por nucleotídeos está intimamente ligada ao estresse tecidual e à ativação imune, alterações na sinalização P2Y9/Lpar4 são relevantes para estudos de inflamação, regulação vascular e metabólica e mudanças de sinalização no microambiente observadas na biologia de doenças.

P2Y9 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Lpar4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

P2Y9 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Lpar4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Lpar4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de P2Y9. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Lpar4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de P2Y9 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via P2Y9 em células tumorais com expressão de Lpar4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.