Orai3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403426-ACT

ORAI3 codifica a Orai3, uma subunidade de canal CRAC (canais de Ca2+ ativados pela liberação de Ca2+) na membrana plasmática, que contribui para a entrada de cálcio operada por estoques (SOCE) após a depleção de Ca2+ no retículo endoplasmático. Ao moldar a dinâmica do Ca2+ citosólico, a Orai3 influencia programas de sinalização a jusante dependentes de Ca2+, incluindo a transcrição mediada por NFAT, a progressão do ciclo celular e a secreção acoplada a estímulos. A função de ORAI3 se cruza com proteínas STIM e com outros membros da família ORAI para ajustar a montagem do canal e a seletividade iônica, modulando assim a excitabilidade celular e as respostas ao estresse. A expressão desregulada de ORAI3 ou a remodelação da SOCE têm sido associadas na literatura a alterações na sinalização proliferativa, no manejo do estresse oxidativo e a fenótipos relevantes para a biologia do câncer e a função de células imunes.

Orai3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ORAI3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Orai3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ORAI3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ORAI3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Orai3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ORAI3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Orai3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Orai3 em células tumorais com expressão de ORAI3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.