NT-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401458-ACT

A neurotrofina 3 (NTF3) codifica a neurotrofina secretada NT-3, um regulador-chave da sobrevivência neuronal, do crescimento de neuritos e da maturação sináptica durante o desenvolvimento e na manutenção de tecidos adultos. A NT-3 sinaliza principalmente por meio de NTRK3/TrkC para ativar as vias MAPK/ERK, PI3K–AKT e PLCγ, integrando suporte trófico com plasticidade dependente de atividade e programas de diferenciação. Além do sistema nervoso, a sinalização dependente de NTF3 influencia a orientação axonal, a função de neurônios sensoriais e as interações neuroimunes por meio da modulação da expressão gênica e da dinâmica do citoesqueleto. A desregulação da sinalização de neurotrofinas, incluindo alterações na atividade do eixo NT-3/TrkC, tem sido associada a fenótipos do neurodesenvolvimento e a mecanismos relevantes para a neurodegeneração e a biologia da dor neuropática.

NT-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NTF3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NT-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NTF3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NTF3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NT-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NTF3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NT-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NT-3 em células tumorais com expressão de NTF3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.