NRAMP 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402423-ACT

SLC11A1 codifica NRAMP1 (natural resistance–associated macrophage protein 1), un trasportatore di ioni metallici bivalenti associato prevalentemente alle membrane dei fagosomi nelle cellule mieloidi. Regolando la disponibilità intrafagosomiale di Fe²⁺ e Mn²⁺, NRAMP1 influenza le risposte antimicrobiche dipendenti dai metalli, la gestione dello stress ossidativo e la maturazione dei fagolisosomi. Questa attività si interseca con le vie di segnalazione dell’immunità innata e con i percorsi di processamento dell’antigene che modellano gli stati di attivazione dei macrofagi e gli output infiammatori. La variazione genetica o l’alterata espressione di SLC11A1 è stata associata a una suscettibilità differenziale a fenotipi infettivi e infiammatori, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici nell’immunometabolismo e nella biologia ospite–patogeno.

NRAMP 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC11A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NRAMP 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC11A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC11A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NRAMP 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC11A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NRAMP 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NRAMP 1 nelle cellule tumorali con espressione di SLC11A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.