NPRL2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402875-ACT

O NPRL2 humano codifica um componente central do complexo GATOR1, um importante regulador negativo da sinalização do mTORC1 que conecta a disponibilidade de aminoácidos ao controle do crescimento celular. Ao promover a contenção da atividade do mTORC1, o NPRL2 sustenta respostas ao estresse por limitação de nutrientes, a regulação da autofagia e a homeostase metabólica, influenciando a síntese proteica e a progressão do ciclo celular. Alterações na expressão ou na função de NPRL2 têm sido associadas à desregulação da via do mTOR observada em diversos contextos de proliferação aberrante e adaptação ao estresse, tornando-o relevante para estudos mecanísticos do controle do crescimento. O NPRL2 também é utilizado como um nó para investigar circuitos de detecção de nutrientes e programas transcricionais a jusante que moldam a sobrevivência celular e a capacidade biossintética.

NPRL2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NPRL2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NPRL2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NPRL2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NPRL2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NPRL2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NPRL2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NPRL2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NPRL2 em células tumorais com expressão de NPRL2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.