NPAS4 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-402373-LAC

NPAS4 (neuronal PAS domain protein 4) è un fattore di trascrizione PAS bHLH (basic helix–loop–helix) dipendente dall’attività, che collega la segnalazione del calcio a rapidi programmi trascrizionali nei neuroni. Regola l’equilibrio eccitazione–inibizione controllando reti geniche coinvolte nella formazione delle sinapsi, nello scaling sinaptico inibitorio e nella segnalazione delle neurotrofine, incluse vie associate alla trascrizione responsiva a BDNF. NPAS4 è implicato nella plasticità neuronale, nell’apprendimento e nella memoria, e nei circuiti responsivi allo stress; un’alterata regolazione di NPAS4 è stata associata a fenotipi rilevanti per malattie neuropsichiatriche e neurodegenerative. In quanto regolatore trascrizionale sensibile al contesto, è ampiamente utilizzato per studiare l’espressione genica indotta da stimoli e gli adattamenti a livello di circuito in modelli neuronali umani.

Le particelle di attivazione lentivirale NPAS4 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di NPAS4 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale NPAS4 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione NPAS4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di NPAS4. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo NPAS4 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.