NMDAζ1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400593-ACT

GRIN1 codifica la subunità del recettore NMDA NMDAζ1 (nota anche come GluN1), un componente essenziale dei recettori ionotropici del glutammato eterotetramerici che mediano la neurotrasmissione eccitatoria permeabile al Ca²⁺ nel sistema nervoso centrale umano. I recettori contenenti NMDAζ1 integrano l’attività sinaptica con vie di segnalazione a valle che regolano la plasticità sinaptica, lo sviluppo neuronale e l’espressione genica dipendente dall’attività, inclusi processi associati a CaMK/CREB e MAPK. La funzione di GRIN1 è strettamente legata all’equilibrio eccitatorio/inibitorio, al potenziamento a lungo termine e alla maturazione delle reti neuronali, rendendolo un nodo chiave nelle vie che governano apprendimento e memoria. Una segnalazione alterata dei recettori NMDA e varianti di GRIN1 sono state associate a fenotipi neuroevolutivi e neuropsichiatrici, alimentando studi meccanicistici sulla composizione del recettore e sul controllo trascrizionale.

NMDAζ1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GRIN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NMDAζ1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GRIN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GRIN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NMDAζ1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GRIN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NMDAζ1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NMDAζ1 nelle cellule tumorali con espressione di GRIN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.