NMDAε2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400654-ACT

GRIN2B codifica a subunidade do recetor NMDA humano NMDAε2 (GluN2B), um componente de um canal iónico ativado por glutamato que regula o influxo de Ca²⁺ durante a neurotransmissão excitatória. Recetores que contêm NMDAε2 moldam a plasticidade sináptica, a expressão génica dependente de atividade e o desenvolvimento neuronal através do acoplamento às vias de sinalização CaMK/CREB, às vias MAPK e a programas de transcrição a jusante. A função de GRIN2B está intimamente ligada ao equilíbrio excitação–inibição, à maturação das espinhas dendríticas e ao refinamento de circuitos no sistema nervoso central. Alterações na expressão de GRIN2B ou na sinalização do recetor NMDA têm sido associadas a mecanismos de doenças do neurodesenvolvimento e neuropsiquiátricas, incluindo disfunção cognitiva, fenótipos relacionados com epilepsia e sinaptopatias.

NMDAε2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GRIN2B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NMDAε2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GRIN2B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GRIN2B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NMDAε2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GRIN2B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NMDAε2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NMDAε2 em células tumorais com expressão de GRIN2B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.