NHE-9 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410416-ACT

SLC9A9 codifica lo scambiatore endosomiale Na+/H+ NHE-9, una proteina di membrana multipasso che regola il pH del lume e l’omeostasi del sodio negli endosomi di riciclo e di smistamento. Modulando l’acidificazione endosomiale, NHE-9 influenza il traffico dei recettori, la dissociazione ligando–recettore e l’equilibrio tra riciclo e degradazione lisosomiale, plasmando così gli output di segnalazione e la composizione delle proteine di membrana. Questa funzione collega SLC9A9 alle reti di trasporto vescicolare e ai processi pH-dipendenti che incidono sull’attività sinaptica, sulla regolazione dei trasportatori di nutrienti e sulle risposte cellulari allo stress. Alterazioni dell’espressione di SLC9A9 o del controllo del pH endosomiale sono state associate a fenotipi neuroevolutivi e ad altre condizioni legate a traffico e segnalazione disfunzionali.

NHE-9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC9A9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NHE-9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC9A9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC9A9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NHE-9. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC9A9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NHE-9 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NHE-9 nelle cellule tumorali con espressione di SLC9A9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.