NGAL Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401838-ACT

LCN2 codifica a lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL), uma lipocalina secretada que se liga a complexos sideróforo–ferro e modula o tráfego de ferro, a defesa antimicrobiana e as respostas epiteliais ao stress. A NGAL participa na sinalização da imunidade inata e em programas inflamatórios, incluindo o crosstalk com vias conduzidas por NF-κB e por citocinas, e é frequentemente induzida por lesão tecidular e stress celular. Na biologia humana, alterações na expressão de LCN2/NGAL têm sido associadas a inflamação desregulada, remodelação metabólica e alterações do microambiente associado a tumores, tornando-a um marcador útil e um nó mecanístico para o estudo das interações imunoepiteliais. As suas funções na dinâmica da matriz extracelular e em processos associados a proteases ligam ainda a NGAL a contextos como disfunção de barreira e fenótipos de remodelação.

NGAL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LCN2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NGAL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LCN2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LCN2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NGAL. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LCN2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NGAL no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NGAL em células tumorais com expressão de LCN2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.