Neuro D Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400375-ACT

NEUROD1 codifica o Neuro D, um fator de transcrição do tipo basic helix–loop–helix que promove a especificação do destino celular e a diferenciação terminal em linhagens neurogênicas e endócrinas. O Neuro D regula redes gênicas envolvidas na maturação neuronal, na função sináptica e no desenvolvimento das ilhotas pancreáticas, coordenando programas transcricionais a jusante de vias de sinalização do desenvolvimento. Em células humanas, alterações na expressão de NEUROD1 ou no seu controle regulatório têm sido associadas a fenótipos do neurodesenvolvimento e à diferenciação endócrina desregulada, tornando-o um nó útil para estudar o comprometimento de linhagem e a circuitaria transcricional. A modulação experimental de NEUROD1 oferece uma abordagem prática para investigar o estado de diferenciação, a regulação gênica dependente de cromatina e a manutenção da identidade celular.

Neuro D O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NEUROD1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Neuro D O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NEUROD1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NEUROD1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Neuro D. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NEUROD1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Neuro D no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Neuro D em células tumorais com expressão de NEUROD1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.