netrin-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401871-ACT

Il gene umano **NTN1** codifica la netrina-1, un segnale guida secreto, correlato alle laminine, che dirige l’orientamento degli assoni e la migrazione neuronale, influenzando al contempo il comportamento delle cellule epiteliali ed endoteliali. La netrina-1 interagisce con recettori quali DCC e i membri della famiglia UNC5 per coordinare la dinamica del citoscheletro, l’adesione e la segnalazione di sopravvivenza, con effetti a valle su processi che includono la crescita dei neuriti, la funzione di barriera e il rimodellamento angiogenico. Oltre allo sviluppo, l’attività di **NTN1** è oggetto di studio in contesti di infiammazione e rimodellamento tissutale, in cui variazioni nell’espressione della netrina-1 possono rimodulare il traffico leucocitario e le risposte vascolari. Una segnalazione **NTN1** disregolata è stata associata a fenotipi neurosviluppo-correlati e ad alterazioni della biologia del microambiente tumorale, rendendolo un nodo utile per l’analisi delle vie di segnalazione in diversi sistemi cellulari.

netrin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NTN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

netrin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NTN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NTN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di netrin-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NTN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da netrin-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via netrin-1 nelle cellule tumorali con espressione di NTN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.