Partículas Lentivirales de Activación (m) NEDD4: sc-421848-LAC

El gen Nedd4 de ratón codifica NEDD4, una ligasa E3 de ubiquitina con dominio HECT que regula el recambio proteico y la señalización al catalizar la transferencia de ubiquitina a receptores de membrana, canales iónicos e intermediarios de señalización. Mediante el reconocimiento, a través de dominios WW, de sustratos con motivo PY, NEDD4 influye en la endocitosis y el tráfico de proteínas de superficie y modula vías como PI3K–AKT, TGF-β y la señalización asociada a EGFR, con efectos posteriores sobre el crecimiento, la supervivencia y la migración celulares. La actividad de NEDD4 también se interseca con redes de proteostasis y de respuesta al estrés, configurando la remodelación dependiente de ubiquitina de los complejos de señalización celular. La ubiquitinación dependiente de NEDD4 desregulada se ha implicado en fenotipos relevantes para enfermedades, como alteraciones del transporte epitelial, señalización proliferativa aberrante y disfunción inmunitaria y neuronal, lo que la convierte en un nodo útil para estudios mecanísticos.

Las partículas de activación lentiviral NEDD4 (m) responden a esta necesidad al empaquetar el sistema completo de activación transcripcional del mediador de activación sinérgica (SAM) en partículas lentivirales de alto título listas para la transducción, lo que permite una regulación al alza eficiente de Nedd4 en una gama más amplia de tipos de células humanas.

Las partículas de activación lentiviral NEDD4 (m) suministran todos los componentes funcionales del sistema mediador de activación sinérgica (SAM) a través de la transducción lentiviral. El sistema comprende tres preparaciones de partículas cotransducidas en las células diana: una que codifica dCas9 catalíticamente inactivo (mutaciones D10A y N863A) fusionado al dominio de transactivación VP64 con un gen de resistencia a la blasticidina; otra que codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1 con un gen de resistencia a la higromicina; y otra que codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 con un gen de resistencia a la puromicina. Tras la transducción lentiviral y la integración genómica de los casetes de expresión, los componentes del SAM se expresan de forma estable y se ensamblan en el locus diana dentro de la región promotora proximal, aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción Nedd4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma cooperativa para reclutar la maquinaria transcripcional endógena e impulsar la regulación al alza sostenida de la expresión endógena de NEDD4. El uso de dCas9 inactivo frente a nucleasas evita la introducción de roturas de ADN de doble cadena y preserva el locus genómico nativo Nedd4 y la arquitectura reguladora.

El formato lentiviral ofrece varias ventajas prácticas: la integración genómica estable permite la activación hereditaria a lo largo de las divisiones celulares; las preparaciones de partículas de alto título eliminan la necesidad de producir el virus internamente; y la compatibilidad con tipos de células primarias, no divisibles y resistentes a la transfección amplía la accesibilidad experimental. La transducción exitosa puede confirmarse y enriquecerse mediante selección con triple antibiótico utilizando puromicina, higromicina y blasticidina.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.