N-Myc Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400253-ACT

MYCN codifica o fator de transcrição humano N-Myc, uma proteína do tipo basic helix–loop–helix com zíper de leucina, que forma heterodímeros com MAX para se ligar a elementos regulatórios E-box e coordenar programas amplos de expressão gênica. O N-Myc ajuda a regular a progressão do ciclo celular, a biogênese de ribossomos, o metabolismo, as respostas ao estresse de replicação do DNA e o estado de diferenciação, por meio da integração com a atividade da rede MYC/MAX e do recrutamento de cofactores associados à cromatina. A expressão desregulada de MYCN está ligada a alterações na capacidade proliferativa e em programas de linhagem em múltiplos contextos tumorais, tornando-o um alvo amplamente utilizado para estudar circuitos transcricionais oncogênicos. Seus efeitos a jusante sobre a transcrição pela RNA polimerase II, a acessibilidade da cromatina e vias de sinalização de fatores de crescimento fornecem leituras mensuráveis para pesquisas mecanísticas.

N-Myc O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MYCN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

N-Myc O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MYCN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MYCN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de N-Myc. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MYCN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de N-Myc no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via N-Myc em células tumorais com expressão de MYCN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.