myotubularin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403912-ACT

MTM1 codifica la miotubularina, una fosfatasi lipidica che defosforila il fosfatidilinositolo 3-fosfato e il fosfatidilinositolo (3,5)-bisfosfato, regolando così la segnalazione dei fosfoinositidi nei compartimenti endosomiali e di traffico di membrana. Attraverso il controllo dell’endocitosi, della dinamica di membrana legata all’autofagia e dell’organizzazione del citoscheletro, la miotubularina contribuisce a mantenere l’architettura cellulare e l’omeostasi degli organelli. Nel muscolo scheletrico, l’attività di MTM1 è strettamente connessa alle vie di rimodellamento di membrana necessarie per l’integrità delle fibre muscolari e per il supporto dell’eccitazione–contrazione. Varianti con perdita di funzione in MTM1 sono associate alla miopatia miotubulare legata all’X, stimolando studi meccanicistici sul turnover dei fosfoinositidi e sulla biologia delle cellule muscolari.

myotubularin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MTM1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

myotubularin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MTM1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MTM1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di myotubularin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MTM1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da myotubularin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via myotubularin nelle cellule tumorali con espressione di MTM1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.