MIA2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-418205-ACT

O MIA2 humano (melanoma inhibitory activity member 2) codifica uma grande proteína secretada/associada ao RE, implicada no tráfego de proteínas e em processos relacionados à matriz extracelular, com ligações funcionais proeminentes à biologia celular hepática. O MIA2 participa da homeostase da via secretória e tem sido associado à regulação da diferenciação celular, de respostas ao estresse e de programas de remodelamento tecidual que se cruzam com a sinalização inflamatória e fibrótica. Alterações na expressão de MIA2 foram relatadas em diversas patologias centradas no fígado e em fenótipos relevantes para malignidade, sustentando seu uso como um marcador/ferramenta molecular para estudar interações no microambiente tumoral e a dinâmica do proteoma secretório. Como resultado, o MIA2 é de interesse para estudos mecanísticos em vias dependentes de secreção, sinalização extracelular e regulação transcricional associada a doenças.

MIA2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MIA2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MIA2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MIA2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MIA2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MIA2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MIA2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MIA2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MIA2 em células tumorais com expressão de MIA2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.