melanopsin CRISPR Activationプラスミド (m): sc-424378-ACT

マウスのOpn4はメラノプシンをコードしており、主に内因性光感受性網膜神経節細胞（ipRGC）に発現する網膜オプシンで、非画像形成性の光受容を担います。メラノプシンのシグナル伝達は、細胞内カルシウム濃度を上昇させ膜の興奮性を調節するGタンパク質共役型の光情報伝達カスケードを作動させ、光検出を概日リズムの光同調、対光反射、睡眠–覚醒の制御へと結び付けます。視交叉上核および他の視床下部標的を含む網膜—脳経路を介して、Opn4は神経内分泌リズムや光依存的行動に影響を及ぼします。メラノプシン依存性回路の機能不全は、概日時計のタイミング異常、瞳孔反応の変化、光過敏といった表現型と関連づけられており、神経行動および網膜研究において重要です。

melanopsin CRISPR活性化プラスミド（m）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性Opn4の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

melanopsin CRISPR 活性化プラスミド (m) は、ヒト細胞株における Opn4 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はOpn4転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性melanopsinの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のOpn4遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるmelanopsin依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびOpn4発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるmelanopsin経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。