melanopsin Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424378-ACT

Opn4 del topo codifica la melanopsina, un’opsina retinica espressa principalmente nelle cellule ganglionari retiniche intrinsecamente fotosensibili, che mediano la fotorecezione non legata alla formazione di immagini. La segnalazione della melanopsina attiva cascate di fototrasduzione accoppiate a proteine G che aumentano il calcio intracellulare e modulano l’eccitabilità di membrana, collegando il rilevamento della luce al foto-entrainment circadiano, al riflesso fotomotore pupillare e alla regolazione sonno–veglia. Attraverso vie retina-cervello che coinvolgono il nucleo soprachiasmatico e altri bersagli ipotalamici, Opn4 influenza i ritmi neuroendocrini e i comportamenti dipendenti dalla luce. La disregolazione dei circuiti dipendenti dalla melanopsina è stata associata ad alterazioni della tempistica circadiana, a risposte pupillari modificate e a fenotipi di sensibilità alla luce rilevanti per la ricerca neurocomportamentale e retinica.

melanopsin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Opn4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

melanopsin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Opn4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Opn4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di melanopsin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Opn4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da melanopsin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via melanopsin nelle cellule tumorali con espressione di Opn4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.