MEK-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401459-ACT

Il gene umano MAP2K4 codifica MEK-4 (MKK4), una chinasi MAPKK a doppia specificità che trasmette segnali di stress e di citochine alle vie MAPK a valle JNK e p38. Fosforilando MAPK come MAPK8/9 (JNK) e MAPK14 (p38), MEK-4 regola programmi trascrizionali che controllano apoptosi, infiammazione, differenziamento e motilità cellulare. La segnalazione dipendente da MAP2K4 interseca le vie di TGF-β, TNF e dell’immunità innata, modulando le risposte cellulari allo stress del microambiente. La disregolazione o alterazioni genetiche di MAP2K4 sono state riportate in molteplici contesti patologici, inclusi cambiamenti della segnalazione associati al cancro e la patobiologia infiammatoria, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici sul comportamento delle reti MAPK.

MEK-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAP2K4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MEK-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAP2K4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAP2K4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MEK-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAP2K4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MEK-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MEK-4 nelle cellule tumorali con espressione di MAP2K4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.