Med8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404402-ACT

O gene humano **MED8** codifica a Med8, uma subunidade central do complexo **Mediator** que faz a ponte entre fatores de transcrição específicos de sequência e a **RNA polimerase II**, coordenando o início da transcrição e a liberação/escape do promotor. Por meio da regulação da expressão gênica dependente do Mediator, **MED8** contribui para programas celulares amplos, incluindo controle do ciclo celular, diferenciação e transcrição responsiva ao estresse. Como integrador transcricional, a Med8 influencia os resultados de vias a jusante de diversas redes de sinalização ao modular o recrutamento da Pol II e o alongamento produtivo em loci-alvo. A desregulação de componentes do Mediator, incluindo **MED8**, é estudada no contexto de estados transcricionais alterados associados a fenótipos do desenvolvimento e a programas de expressão gênica relevantes para o câncer.

Med8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MED8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Med8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MED8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MED8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Med8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MED8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Med8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Med8 em células tumorais com expressão de MED8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.