MDM2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400045-ACT

MDM2 codifica uma ligase E3 de ubiquitina que atua como o principal regulador negativo de TP53, promovendo a ubiquitinação de p53, sua exportação nuclear e a degradação pelo proteassoma, a fim de limitar as respostas a danos no DNA. Por meio de regulação por feedback e da integração com a sinalização de ATM/ATR, MDM2 influencia checkpoints do ciclo celular, apoptose, senescência e programas transcricionais adaptativos ao estresse. A expressão ou atividade desregulada de MDM2 pode alterar o resultado da via de p53 e é frequentemente estudada em cânceres nos quais a proteostase e o controle de checkpoints alterados contribuem para a aptidão das células tumorais. MDM2 também se conecta a redes adicionais, incluindo a proliferação mediada por RB/E2F e a sinalização PI3K–AKT, tornando-se um nó útil para mapeamento de vias e genômica funcional.

MDM2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MDM2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MDM2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MDM2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MDM2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MDM2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MDM2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MDM2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MDM2 em células tumorais com expressão de MDM2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.