MDA5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401962-ACT

IFIH1 codifica a MDA5, uma helicase de RNA citosólica da família DExD/H-box que atua como recetor de reconhecimento de padrões para RNA longo de dupla cadeia gerado durante infeções virais. Após a ligação ao RNA, a MDA5 oligomeriza e sinaliza através de MAVS para ativar TBK1/IKKε, IRF3/IRF7 e NF-κB, impulsionando programas transcricionais de interferão do tipo I e pró-inflamatórios. Este eixo da imunidade inata cruza-se com a sinalização JAK–STAT e molda a restrição antiviral, as redes de citocinas e a apresentação de antigénios. A atividade desregulada de IFIH1/MDA5 tem sido implicada em fenótipos inflamatórios mediados por interferão e em associações genéticas com autoimunidade, tornando-o um alvo frequente para estudos mecanísticos de deteção inata e homeostase imunitária.

MDA5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de IFIH1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MDA5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus IFIH1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição IFIH1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MDA5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus IFIH1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MDA5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MDA5 em células tumorais com expressão de IFIH1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.