MCM2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-421591-ACT

Mcm2 codifica a subunidade MCM2 do complexo helicase de manutenção de minicromossomos (MCM2–7), um componente essencial da maquinaria eucariótica de licenciamento da replicação do DNA. A MCM2 participa da montagem do complexo de pré-replicação nas origens de replicação e sustenta a progressão da fase S ao permitir o disparo das origens e o desenrolamento da forquilha de replicação em coordenação com CDC45 e o complexo GINS. A regulação rigorosa da abundância de MCM2 e de seu carregamento na cromatina está ligada às respostas ao estresse replicativo, à sinalização ATR/CHK1 e à manutenção da estabilidade do genoma. A atividade ou expressão desregulada de MCM2 é frequentemente associada a estados hiperproliferativos e instabilidade cromossômica, tornando-a um marcador amplamente utilizado e um nó mecanístico em estudos de controle do ciclo celular e de respostas a danos no DNA.

MCM2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Mcm2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MCM2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Mcm2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Mcm2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MCM2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Mcm2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MCM2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MCM2 em células tumorais com expressão de Mcm2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.