MANEAL Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-414652-ACT

MANEAL codifica uma proteína associada à membrana, ainda pouco caracterizada, cuja localização é prevista em compartimentos do sistema endomembranar e que pode contribuir para o tráfego intracelular e para o processamento de proteínas na via secretória. Anotações emergentes e características de domínios sugerem possíveis ligações ao transporte entre RE–Golgi ou a processos de organização de membranas que influenciam a proteostase e as respostas ao estresse celular. Assim, MANEAL é de interesse para estudar como a dinâmica do sistema endomembranar molda a regulação do estado celular, incluindo programas de proliferação e diferenciação. Padrões de expressão alterados relatados em conjuntos de dados genômicos e transcriptômicos motivam a investigação de MANEAL como um modulador dependente do contexto em fenótipos celulares relevantes para doenças, particularmente em modelos nos quais a integridade da via secretória está comprometida.

MANEAL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MANEAL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MANEAL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MANEAL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MANEAL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MANEAL. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MANEAL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MANEAL no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MANEAL em células tumorais com expressão de MANEAL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.