MAGI-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402283-ACT

MAGI1 codifica per MAGI-1, una proteina scaffold della famiglia delle guanilato chinasi associate alla membrana (MAGUK), arricchita nelle giunzioni serrate e nei siti sinaptici, dove coordina complessi multiproteici che modellano la polarità epiteliale e l’adesione cellula-cellula. Attraverso interazioni mediate dai domini PDZ con componenti giunzionali e adattatori di segnalazione, MAGI-1 contribuisce a organizzare vie che regolano l’integrità della barriera, la dinamica del citoscheletro e la trasduzione del segnale associata ai recettori, inclusa l’interazione (cross-talk) con PI3K/AKT e con reti di fosfatasi correlate. Un’espressione alterata di MAGI1 o una sua mislocalizzazione a livello delle giunzioni è stata associata alla perturbazione dell’architettura tissutale e a programmi di rimodellamento rilevanti per la biologia del cancro, l’infiammazione e fenotipi associati alla metastasi. Queste caratteristiche rendono MAGI1 un nodo utile per studiare come gli scaffold giunzionali integrino la segnalazione con il mantenimento strutturale nelle cellule umane.

MAGI-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAGI1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MAGI-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAGI1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAGI1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MAGI-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAGI1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MAGI-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MAGI-1 nelle cellule tumorali con espressione di MAGI1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.