LLH1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404079-ACT

Il gene umano PLOD1 codifica la lisil idrossilasi 1 (LLH1), una diossigenasi dipendente da Fe2+/2-ossoglutarato residente nel reticolo endoplasmatico (ER) che idrossila i residui di lisina nel procollagene, un prerequisito per una stabile reticolazione intermolecolare e per il corretto assemblaggio della matrice extracellulare. Regolando la maturazione del collagene, LLH1 influenza la meccanica della matrice, la segnalazione cellula–matrice e i processi di rimodellamento tissutale che si intersecano con programmi associati alla fibrosi e con la riparazione delle ferite. Un’alterata attività di PLOD1 compromette la fibrillogenesi del collagene e l’organizzazione della membrana basale, ed è stata collegata a fenotipi di fragilità del tessuto connettivo e a una più ampia disregolazione della matrice osservata in diversi contesti patologici. Di conseguenza, PLOD1/LLH1 è frequentemente oggetto di studio nelle ricerche sulla biosintesi del collagene, sulla proteostasi dell’ER e sulla modulazione, guidata dalla ECM, del comportamento cellulare.

LLH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PLOD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LLH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PLOD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PLOD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LLH1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PLOD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LLH1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LLH1 nelle cellule tumorali con espressione di PLOD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.